При болезни Альцгеймера (БА) отсутствуют белковые биомаркеры, отражающие множественную лежащую в ее основе патофизиологию, что затрудняет прогресс диагностики и лечения. Здесь мы используем комплексную протеомику для идентификации биомаркеров спинномозговой жидкости (СМЖ), которые представляют широкий спектр патофизиологии БА. Мультиплексная масс-спектрометрия выявила примерно 3500 и примерно 12 000 белков в AD CSF и головном мозге соответственно. Сетевой анализ протеома головного мозга выявил 44 модуля биоразнообразия, 15 из которых перекрывались с протеомом спинномозговой жидкости. Маркеры AD CSF в этих перекрывающихся модулях свернуты в пять белковых групп, представляющих различные патофизиологические процессы. Количество синапсов и метаболитов в головном мозге при болезни Альцгеймера уменьшается, но количество СМЖ увеличивается, в то время как богатая глией миелинизация и иммунные группы в мозге и СМЖ увеличиваются. Последовательность и специфичность изменений в панели были подтверждены более чем в 500 дополнительных образцах спинномозговой жидкости. Эти группы также определили биологические подгруппы при бессимптомном АД. В целом, эти результаты являются многообещающим шагом на пути к веб-инструментам биомаркеров для клинического применения при болезни Альцгеймера.
Болезнь Альцгеймера (БА) является наиболее распространенной причиной нейродегенеративной деменции во всем мире и характеризуется широким спектром дисфункций биологических систем, включая синаптическую передачу, глиальный иммунитет и митохондриальный метаболизм (1-3). Однако установленные белковые биомаркеры по-прежнему ориентированы на обнаружение амилоида и тау-белка и, следовательно, не могут отражать эту разнообразную патофизиологию. Эти «основные» белковые биомаркеры, которые наиболее надежно измеряются в спинномозговой жидкости (СМЖ), включают (i) бета-амилоидный пептид 1-42 (Aβ1-42), который отражает образование кортикальных амилоидных бляшек; (ii) тотальный тау, признак дегенерации аксонов; (iii) фосфо-тау (p-тау), представитель патологического гиперфосфорилирования тау (4-7). Хотя эти биомаркеры спинномозговой жидкости значительно облегчили обнаружение «выраженных» белковых заболеваний AD (4-7), они представляют собой лишь небольшую часть сложной биологии, лежащей в основе заболевания.
Отсутствие патофизиологического разнообразия биомаркеров БА привело ко многим проблемам, включая (i) неспособность идентифицировать и количественно оценить биологическую гетерогенность пациентов с АД, (ii) недостаточную оценку тяжести и прогрессирования заболевания, особенно на доклинической стадии, и ( iii) разработка терапевтических препаратов, которые не смогли полностью решить все аспекты неврологического ухудшения. Наша зависимость от ориентировочной патологии для описания болезни Альцгеймера, связанной с сопутствующими заболеваниями, только усугубляет эти проблемы. Все больше и больше данных показывают, что у большинства пожилых людей с деменцией имеется более одной патологической характеристики снижения когнитивных функций (8). До 90% и более людей с патологией AD также имеют сосудистые заболевания, включения TDP-43 или другие дегенеративные заболевания (9). Эти высокие доли патологического совпадения нарушили нашу нынешнюю диагностическую систему деменции, и необходимо более полное патофизиологическое определение заболевания.
Ввиду острой необходимости в различных биомаркерах БА в этой области все чаще применяется метод «омики», основанный на общей системе обнаружения биомаркеров. Альянс Ускоренного фармацевтического партнерства (AMP)-AD был запущен в 2014 году и находится в авангарде программы. Эти междисциплинарные усилия Национальных институтов здравоохранения, научных кругов и промышленности направлены на использование системных стратегий для лучшего определения патофизиологии БА и разработки диагностического анализа биоразнообразия и стратегий лечения (10). В рамках этого проекта сетевая протеомика стала многообещающим инструментом для развития системных биомаркеров при болезни Альцгеймера. Этот объективный подход, основанный на данных, организует сложные наборы протеомных данных в группы или «модули» совместно экспрессируемых белков, которые связаны с конкретными типами клеток, органеллами и биологическими функциями (11-13). Было проведено почти 12 информативных сетевых протеомных исследований мозга при болезни Альцгеймера (13-23). В целом, эти анализы показывают, что протеом сети мозга при AD поддерживает высококонсервативную модульную организацию в независимых когортах и во многих областях коры. Кроме того, некоторые из этих модулей демонстрируют воспроизводимые изменения в распространенности, связанной с AD, в наборах данных, отражая патофизиологию множества заболеваний. В совокупности эти результаты демонстрируют многообещающую отправную точку для открытия протеома сети мозга как системного биомаркера при болезни Альцгеймера.
Чтобы превратить протеом сети мозга при AD в клинически полезные системные биомаркеры, мы объединили сеть, полученную из мозга, с протеомным анализом AD CSF. Этот комплексный подход привел к идентификации пяти многообещающих наборов биомаркеров спинномозговой жидкости, которые связаны с широким спектром патофизиологии головного мозга, включая синапсы, кровеносные сосуды, миелинизацию, воспаление и дисфункцию метаболических путей. Мы успешно проверили эти панели биомаркеров посредством многократного анализа репликации, включая более 500 образцов спинномозговой жидкости от различных нейродегенеративных заболеваний. Эти проверочные анализы включают исследование групповых целей в спинномозговой жидкости пациентов с бессимптомным БА (AsymAD) или выявление признаков аномального накопления амилоида в нормальной когнитивной среде. Эти анализы подчеркивают значительную биологическую гетерогенность в популяции AsymAD и идентифицируют панельные маркеры, которые могут позволить подтипировать людей на самых ранних стадиях заболевания. В целом, эти результаты представляют собой ключевой шаг в разработке инструментов белковых биомаркеров, основанных на нескольких системах, которые могут успешно решить многие клинические проблемы, с которыми сталкивается AD.
Основная цель этого исследования — идентифицировать новые биомаркеры спинномозговой жидкости, которые отражают различные патофизиологические процессы головного мозга, приводящие к БА. На рисунке S1 представлена наша методология исследования, которая включает в себя (i) комплексный анализ, основанный на предварительных результатах AD CSF и сетевого протеома головного мозга, для выявления множественных биомаркеров заболеваний спинномозговой жидкости, связанных с мозгом, и (ii) последующую репликацию. Эти биомаркеры находятся в нескольких независимых цереброспинальных текучие когорты. Исследование, ориентированное на открытия, началось с анализа дифференциальной экспрессии спинномозговой жидкости у 20 когнитивно нормальных людей и 20 пациентов с болезнью Альцгеймера в Исследовательском центре болезни Альцгеймера Эмори Гойсуэты (ADRC). Диагноз БА определяется как значительные когнитивные нарушения при наличии низкого уровня Aβ1-42 и повышенных уровней общего тау и р-тау в спинномозговой жидкости [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ИФА (ELISA) )]] (Таблица S1A). Контрольная группа (среднее значение MoCA 26,7 ± 2,2) имела нормальный уровень биомаркеров спинномозговой жидкости.
Человеческая спинномозговая жидкость характеризуется динамическим диапазоном содержания белков, в котором альбумин и другие чрезвычайно распространенные белки могут препятствовать обнаружению представляющих интерес белков (24). Чтобы увеличить глубину обнаружения белков, мы удалили первые 14 белков с высоким содержанием из каждого образца спинномозговой жидкости перед масс-спектрометрическим (МС) анализом (24). Всего с помощью МС было идентифицировано 39 805 пептидов, которые были картированы на 3691 протеоме в 40 образцах. Количественная оценка белка проводится с помощью множественной тандемной массовой метки (TMT) (18, 25). Чтобы восполнить недостающие данные, мы включили только те белки, которые были количественно определены как минимум в 50% образцов в последующем анализе, таким образом, окончательно определив количество 2875 протеомов. Из-за значительной разницы в уровнях общего содержания белка контрольный образец статистически считался выбросом (13) и не был включен в последующий анализ. Значения численности остальных 39 образцов были скорректированы в зависимости от возраста, пола и ковариации партии (13-15, 17, 18, 20, 26).
Используя статистический анализ Стьюдента для оценки дифференциальной экспрессии в наборе данных регрессии, этот анализ выявил белки, уровни распространенности которых были значительно изменены (P <0,05) между контрольными случаями и случаями AD (таблица S2A). Как показано на рисунке 1А, содержание 225 белков при AD было значительно снижено, а содержание 303 белков значительно увеличено. Эти дифференциально экспрессируемые белки включают несколько ранее идентифицированных маркеров AD в спинномозговой жидкости, таких как тау-белок, ассоциированный с микротрубочками (MAPT; P = 3,52 × 10-8), нейрофиламент (NEFL; P = 6,56 × 10-3), белок 43, связанный с ростом. (GAP43; P = 1,46 × 10-5), белок 3, связывающий жирные кислоты (FABP3; P = 2,00 × 10-5), хитиназа 3, подобная 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10-6), нейронный гранулин (NRGN; P = 3,43 × 10–4) и фактор роста нервов VGF (VGF; P = 4,83 × 10–3) (4–6). Однако мы также определили другие очень важные цели, такие как ингибитор диссоциации GDP 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) и связанное с SPARC модульное связывание кальция 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Анализ Gene Ontology (GO) 225 значительно уменьшенных белков выявил тесную связь с процессами в жидкостях организма, такими как метаболизм стероидов, свертывание крови и гормональная активность (рис. 1B и таблица S2B). Напротив, значительно повышенное содержание белка 303 тесно связано со структурой клеток и энергетическим метаболизмом.
(A) График вулкана показывает кратное изменение log2 (ось x) относительно статистического значения P -log10 (ось y), полученного с помощью t-теста, который используется для обнаружения дифференциальной экспрессии между контролем (CT) и Случаи AD протеома спинномозговой жидкости Из всех белков. Белки со значительно сниженными уровнями (P <0,05) при БА показаны синим цветом, а белки со значительно повышенными уровнями при заболевании показаны красным. Выбранный белок помечен. (B) Верхние термины GO, связанные с белком, значительно уменьшаются (синий) и увеличиваются (красный) при AD. Показывает три термина GO с наивысшими z-показателями в области биологических процессов, молекулярных функций и клеточных компонентов. (C) MS измерил уровень MAPT в образце спинномозговой жидкости (слева) и его корреляцию с уровнем тау в образце ELISA (справа). Отображается коэффициент корреляции Пирсона с соответствующим значением P. Из-за отсутствия данных ИФА по одному случаю АД в эти цифры включены значения для 38 из 39 проанализированных случаев. (D) Контролируемый кластерный анализ (P <0,0001, скорректированный Бенджамини-Хохбергом (BH) P <0,01) контрольных образцов и AD CSF обнаружил образцы с использованием 65 наиболее значительно измененных белков в наборе данных. Стандартизируйте, нормализуйте.
Протеомный уровень MAPT тесно связан с независимо измеренным уровнем тау ELISA (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; рисунок 1C), что подтверждает достоверность наших измерений MS. После расщепления трипсином на уровне белка-предшественника амилоида (АРР) специфичные для изоформы пептиды, картированные на С-конце Aβ1-40 и Aβ1-42, не могут быть эффективно ионизированы (27, 28). Таким образом, идентифицированные нами пептиды APP не имеют ничего общего с уровнями Aβ1-42 ELISA. Чтобы оценить дифференциальную экспрессию в каждом случае, мы использовали дифференциально экспрессируемые белки с P <0,0001 [коэффициент ложного обнаружения (FDR) с поправкой P <0,01] для проведения контролируемого кластерного анализа образцов (таблица S2A). Как показано на рисунке 1D, эти 65 высокозначимых белков могут правильно группировать образцы в соответствии с состоянием заболевания, за исключением одного случая AD с контрольными характеристиками. Из этих 65 белков уровень 63 увеличивается при БА, тогда как только два (CD74 и ISLR) снижаются. В общей сложности эти анализы спинномозговой жидкости выявили сотни белков при БА, которые могут служить биомаркерами заболевания.
Затем мы провели независимый сетевой анализ протеома мозга при болезни Альцгеймера. Когорта головного мозга, в которой было сделано это открытие, включала дорсолатеральную префронтальную кору (DLPFC) из контрольной группы (n = 10), случаев болезни Паркинсона (PD; n = 10), смешанной AD/PD (n = 10) и AD (n = 10). ) Образец. Эмери Гойсуэта ADRC. Демографические данные этих 40 случаев были описаны ранее (25) и обобщены в Таблице S1B. Мы использовали TMT-MS для анализа этих 40 тканей головного мозга и репликационной группы из 27 случаев. В общей сложности эти два набора данных о мозге дали 227 121 уникальный пептид, который был картирован на 12 943 протеомах (25). В последующие исследования включались только те белки, которые были количественно определены не менее чем в 50% случаев. Окончательный набор данных открытия содержит 8817 количественно оцененных белков. Отрегулируйте уровни изобилия белка в зависимости от возраста, пола и посмертного интервала (PMI). Анализ дифференциальной экспрессии набора данных после регрессии показал, что >2000 уровней белка были значительно изменены [P <0,05, дисперсионный анализ (ANOVA)] в двух или более когортах заболеваний. Затем мы провели контролируемый кластерный анализ на основе дифференциально экспрессируемых белков и P <0,0001 в сравнениях AD/контроль и/или AD/PD (рис. S2, A и B, таблица S2C). Эти 165 сильно измененных белков четко отражают случаи патологии AD из контрольных образцов и образцов PD, подтверждая сильные специфичные для AD изменения во всем протеоме.
Затем мы использовали алгоритм под названием «Сетевой анализ совместной экспрессии взвешенных генов» (WGCNA) для выполнения сетевого анализа обнаруженного протеома мозга, который организует набор данных в белковые модули со схожими паттернами экспрессии (11-13). В результате анализа было выявлено 44 модуля (M) совместно экспрессируемых белков, отсортированных и пронумерованных от самого большого (M1, n = 1821 белка) до самого маленького (M44, n = 34 белка) (рис. 2A и таблица S2D)). Как упоминалось выше (13) Рассчитайте репрезентативный профиль экспрессии или характерный белок каждого модуля и сопоставьте его с болезненным состоянием и патологией AD, то есть установите альянс Регистра болезней Альцгеймера (CERAD) и шкалы Браака (рис. 2B). В целом, 17 модулей были значимо связаны с нейропатологией AD (P <0,05). Многие из этих модулей, связанных с заболеваниями, также богаты маркерами, специфичными для типа клеток (рис. 2B). Как упоминалось выше (13), обогащение типов клеток определяется путем анализа перекрытия модулей и справочного списка генов, специфичных для типа клеток. Эти гены получены на основе опубликованных данных об изолированных нейронах мыши, эндотелиальных и глиальных клетках. Эксперимент по секвенированию РНК (RNA-seq) (29).
(A) Откройте для себя WGCNA протеома мозга. (B) Двухвесовой среднекорреляционный анализ (BiCor) модульного сигнатурного белка (первого основного компонента экспрессии модульного белка) с нейропатологическими характеристиками AD (вверху), включая показатели CERAD (бляшки Aβ) и Браака (тау-клубки). Интенсивность положительных (красный) и отрицательных (синий) корреляций показаны двухцветной тепловой картой, а звездочки указывают на статистическую значимость (P <0,05). Используйте точный тест Гипергеометрического Фишера (FET) (внизу), чтобы оценить ассоциацию типов клеток каждого белкового модуля. Интенсивность красной штриховки указывает на степень обогащения типов клеток, а звездочка указывает на статистическую значимость (P <0,05). Используйте метод BH для коррекции значения P, полученного на полевом транзисторе. (C) GO-анализ модульных белков. Для каждого модуля или связанной группы модулей показаны наиболее тесно связанные биологические процессы. олиго, олигодендроцит.
Набор из пяти тесно связанных модулей, богатых астроцитами и микроглией (M30, M29, M18, M24 и M5), показал сильную положительную корреляцию с нейропатологией AD (рис. 2B). Анализ онтологии связывает эти глиальные модули с клеточным ростом, пролиферацией и иммунитетом (рис. 2C и таблица S2E). Два дополнительных глиальных модуля, M8 и M22, также сильно активируются при заболевании. M8 тесно связан с путем Toll-подобного рецептора, сигнальным каскадом, который играет ключевую роль во врожденном иммунном ответе (30). В то же время М22 тесно связан с посттрансляционной модификацией. М2, богатый олигодендроцитами, демонстрирует сильную положительную корреляцию с патологией AD и онтологическую связь с синтезом нуклеозидов и репликацией ДНК, что указывает на усиленную пролиферацию клеток при заболеваниях. В целом, эти данные подтверждают повышение уровня глиальных модулей, которое мы ранее наблюдали в протеоме сети AD (13, 17). В настоящее время обнаружено, что многие глиальные модули, связанные с AD, в сети демонстрируют более низкие уровни экспрессии в контрольных случаях и случаях БП, что подчеркивает их специфичность заболевания, которая повышена при AD (рис. S2C).
Только четыре модуля в нашем протеоме сети (M1, M3, M10 и M32) сильно отрицательно коррелируют с патологией AD (P <0,05) (рис. 2, B и C). И M1, и M3 богаты нейрональными маркерами. M1 тесно связан с синаптическими сигналами, а M3 тесно связан с функцией митохондрий. Нет никаких доказательств обогащения типов клеток M10 и M32. M32 отражает связь между M3 и клеточным метаболизмом, тогда как M10 тесно связан с ростом клеток и функцией микротрубочек. По сравнению с AD, все четыре модуля увеличены в контроле и PD, что дает им специфичные для заболевания изменения AD (рис. S2C). В целом, эти результаты подтверждают снижение количества богатых нейронами модулей, которое мы ранее наблюдали при болезни Альцгеймера (13, 17). Подводя итог, можно сказать, что обнаруженный нами сетевой анализ протеома мозга позволил получить измененные при болезни Альцгеймера модули, согласующиеся с нашими предыдущими результатами.
AD характеризуется ранней бессимптомной стадией (AsymAD), на которой у людей наблюдается накопление амилоида без клинического снижения когнитивных функций (5, 31). Эта бессимптомная стадия представляет собой критическое окно для раннего выявления и вмешательства. Ранее мы продемонстрировали сильную модульную сохранение протеома мозговой сети AsymAD и AD в независимых наборах данных (13, 17). Чтобы убедиться, что обнаруженная нами мозговая сеть соответствует предыдущим результатам, мы проанализировали сохранение 44 модулей в реплицированном наборе данных из 27 организаций DLPFC. В число этих организаций входят контрольные (n = 10), случаи АсимАД (n = 8) и АД (n = 9). Контрольные образцы и образцы AD были включены в анализ нашей когорты головного мозга (таблица S1B), в то время как случаи AsymAD были уникальными только в когорте репликации. Эти случаи AsymAD также поступили из банка мозга Эмори Гойзуэта ADRC. Хотя на момент смерти когнитивные функции были нормальными, уровни амилоида были аномально высокими (среднее значение CERAD 2,8 ± 0,5) (таблица S1B).
ТМТ-МС-анализ этих 27 тканей головного мозга привел к количественному определению 11 244 протеомов. В этот окончательный подсчет включаются только те белки, которые количественно определены как минимум в 50% образцов. Этот набор реплицированных данных содержит 8638 (98,0%) из 8817 белков, обнаруженных в ходе нашего анализа мозга, и содержит почти 3000 значительно измененных белков между контрольной группой и когортой AD (P <0,05, после парного t-критерия Тьюки для дисперсионного анализа) ( Таблица S2F). Среди этих дифференциально экспрессируемых белков 910 также показали значительные изменения уровня между AD и контрольными случаями протеома головного мозга (P <0,05, после парного t-критерия ANOVA Тьюки). Стоит отметить, что эти 910 маркеров очень согласованы в направлении изменения между протеомами (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (рис. S3A). Среди повышенных белков белки с наиболее последовательными изменениями между наборами данных в основном являются членами богатых глией модулей M5 и M18 (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 и GFAP). Среди восстановленных белков наиболее последовательные изменения были почти исключительно членами модуля M1 (NPTX2, VGF и RPH3A), связанного с синапсом. Мы дополнительно подтвердили связанные с AD изменения мидкина (MDK), CD44, секретируемого белка 1, связанного с курчавостью (SFRP1) и VGF, с помощью вестерн-блоттинга (рис. S3B). Анализ сохранности модулей показал, что около 80% белковых модулей (34/44) в протеоме мозга были значительно консервативны в наборе данных репликации (z-показатель> 1,96, скорректированный FDR P <0,05) (рис. S3C). Четырнадцать из этих модулей были специально зарезервированы между двумя протеомами (z-показатель> 10, скорректированный FDR P <1,0 × 10-23). В целом, открытие и воспроизведение высокой степени согласованности в дифференциальной экспрессии и модульном составе протеома головного мозга подчеркивает воспроизводимость изменений в белках лобной коры при болезни Альцгеймера. Кроме того, было также подтверждено, что AsymAD и более поздние заболевания имеют очень схожую структуру сети мозга.
Более подробный анализ дифференциальной экспрессии в наборе данных репликации мозга подчеркивает значительную степень изменений белка AsymAD, включая в общей сложности 151 значительно измененный белок между AsymAD и контролем (P <0,05) (рис. S3D). В соответствии с амилоидной нагрузкой уровень АРР в головном мозге пациентов с AsymAD и AD значительно увеличился. MAPT существенно меняется только при болезни Альцгеймера, что согласуется с повышенным уровнем клубков и известной корреляцией со снижением когнитивных функций (5, 7). Богатые глией модули (M5 и M18) в значительной степени отражаются в увеличении количества белков при AsymAD, тогда как модуль M1, связанный с нейронами, является наиболее представительным из сниженных белков при AsymAD. Многие из этих маркеров AsymAD демонстрируют более значительные изменения при симптоматических заболеваниях. Среди этих маркеров — SMOC1, глиальный белок, принадлежащий M18, который связан с опухолями головного мозга и развитием глаз и конечностей (32). MDK представляет собой гепарин-связывающий фактор роста, связанный с ростом клеток и ангиогенезом (33), еще одним членом M18. По сравнению с контрольной группой AsymAD значительно увеличился, за которым последовало большее увеличение AD. Напротив, уровень синаптического белка нейропентраксина 2 (NPTX2) был значительно снижен в мозге AsymAD. NPTX2 ранее был связан с нейродегенерацией и играет общепризнанную роль в обеспечении возбуждающих синапсов (34). В целом, эти результаты показывают множество различных доклинических изменений белка при БА, которые, по-видимому, прогрессируют с тяжестью заболевания.
Учитывая, что мы достигли значительной глубины белкового покрытия при открытии протеома мозга, мы пытаемся более полно понять его перекрытие с транскриптомом AD сетевого уровня. Поэтому мы сравнили обнаруженный нами протеом мозга с модулем, который мы ранее создали в результате измерения на микрочипе 18 204 генов в тканях AD (n = 308) и контрольных (n = 157) DLPFC (13). перекрытие. Всего мы идентифицировали 20 различных модулей РНК, многие из которых продемонстрировали обогащение определенных типов клеток, включая нейроны, олигодендроциты, астроциты и микроглию (рис. 3А). Множественные изменения этих модулей в AD показаны на рисунке 3B. В соответствии с нашим предыдущим анализом перекрытия белок-РНК с использованием более глубокого немеченого протеома MS (около 3000 белков) (13), большинство из 44 модулей в протеомной сети мозга, которые мы обнаружили, находятся в сети транскриптома. В результате нашего открытия и репликации 34 белковых модулей, которые хорошо сохраняются в протеоме мозга, только 14 (~40%) прошли точный тест Фишера (FET), как оказалось, имеют статистически значимое перекрытие с транскриптомом (рис. 3А). Совместим с восстановлением повреждений ДНК (P-M25 и P-M19), трансляцией белков (P-M7 и P-M20), связыванием/сплайсингом РНК (P-M16 и P-M21) и нацеливанием на белки (P-M13 и P- M23) не перекрывается с модулями транскриптома. Следовательно, хотя в текущем анализе перекрытия используется более глубокий набор протеомных данных (13), большая часть протеома сети AD не картируется в сети транскриптома.
(A) Гипергеометрический FET демонстрирует обогащение маркерами, специфичными для типа клеток, в модуле РНК транскриптома AD (вверху) и степень перекрытия между модулями РНК (ось x) и белка (ось y) мозга AD. (нижний) . Интенсивность красной штриховки указывает на степень обогащения типов клеток на верхней панели и интенсивность перекрытия модулей на нижней панели. Звездочки указывают статистическую значимость (P <0,05). (B) Степень корреляции между характерными генами каждого модуля транскриптома и статусом AD. Модули слева наиболее отрицательно коррелируют с AD (синий), а модули справа наиболее положительно коррелируют с AD (красный). Логарифмически преобразованное значение P, скорректированное по BH, указывает степень статистической значимости каждой корреляции. (C) Значительное перекрытие модулей с общим обогащением типов клеток. (D) Корреляционный анализ изменения log2 кратности меченого белка (ось x) и РНК (ось y) в перекрывающемся модуле. Отображается коэффициент корреляции Пирсона с соответствующим значением P. Микро, микроглия; небесные тела, астроциты. КТ, контроль.
Большинство перекрывающихся модулей белков и РНК имеют схожие профили обогащения типов клеток и согласованные направления изменений AD (рис. 3, B и C). Другими словами, связанный с синапсом модуль М1 протеома головного мозга (PM1) картирован с тремя гомологичными модулями РНК, богатыми нейронами (R-M1, R-M9 и R-M16), которые находятся при болезни Альцгеймера. Оба показали, что пониженный уровень. Аналогично, богатые глией белковые модули M5 и M18 перекрываются с модулями РНК, богатыми астроцитами и микроглиальными маркерами (R-M3, R-M7 и R-M10), и активно участвуют в развитии заболеваний. Эти общие модульные особенности двух наборов данных дополнительно подтверждают обогащение типов клеток и связанные с заболеваниями изменения, которые мы наблюдали в протеоме мозга. Однако мы наблюдали множество существенных различий между уровнями РНК и белка отдельных маркеров в этих общих модулях. Корреляционный анализ дифференциальной экспрессии протеомики и транскриптомики молекул внутри этих перекрывающихся модулей (рис. 3D) подчеркивает это несоответствие. Например, APP и несколько других белков глиального модуля (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 и SFRP1) показали значительное увеличение протеома AD, но почти не было изменений в транскриптоме AD. Эти специфичные для белка изменения могут быть тесно связаны с амилоидными бляшками (23, 35), что подчеркивает протеом как источник патологических изменений, и эти изменения могут не отражаться в транскриптоме.
После независимого анализа обнаруженных нами протеомов головного мозга и спинномозговой жидкости мы провели комплексный анализ двух наборов данных для выявления биомаркеров AD CSF, связанных с патофизиологией сети головного мозга. Сначала мы должны определить перекрытие двух протеомов. Хотя широко признано, что спинномозговая жидкость отражает нейрохимические изменения в головном мозге при болезни Альцгеймера (4), точная степень перекрытия между мозгом при болезни Альцгеймера и протеомом спинномозговой жидкости неясна. Сравнивая количество общих генных продуктов, обнаруженных в наших двух протеомах, мы обнаружили, что почти 70% (n = 1936) белков, идентифицированных в спинномозговой жидкости, также были количественно определены в мозге (рис. 4А). Большинство из этих перекрывающихся белков (n = 1721) сопоставлены с одним из 44 модулей совместной экспрессии из набора данных головного мозга (рис. 4B). Как и ожидалось, шесть крупнейших модулей мозга (от M1 до M6) продемонстрировали наибольшее перекрытие спинномозговой жидкости. Однако существуют мозговые модули меньшего размера (например, M15 и M29), которые достигают неожиданно высокой степени перекрытия, превышающей размер мозгового модуля в два раза. Это побуждает нас принять более подробный, статистически обоснованный метод расчета перекрытия между мозгом и спинномозговой жидкостью.
(A и B) Белки, обнаруженные в наборах данных головного мозга и спинномозговой жидкости, перекрываются. Большинство из этих перекрывающихся белков связаны с одним из 44 модулей совместной экспрессии сети совместной экспрессии мозга. (C) Обнаружьте перекрытие между протеомом спинномозговой жидкости и протеомом сети мозга. Каждая строка тепловой карты представляет собой отдельный анализ перекрытия гипергеометрического полевого транзистора. В верхнем ряду показано перекрытие (серая/черная заливка) между модулем мозга и всем протеомом спинномозговой жидкости. Вторая линия показывает, что перекрытие между модулями мозга и белком спинномозговой жидкости (заштриховано красным) значительно усиливается при AD (P <0,05). Третий ряд показывает, что перекрытие между модулями мозга и белком спинномозговой жидкости (синяя заливка) значительно снижается при болезни Альцгеймера (P <0,05). Используйте метод BH для коррекции значения P, полученного на полевом транзисторе. (D) Панель складного модуля на основе ассоциации типов ячеек и связанных с ними терминов GO. Эти панели содержат в общей сложности 271 белок, связанный с мозгом, которые имеют значимую дифференциальную экспрессию в протеоме спинномозговой жидкости.
Используя односторонние полевые транзисторы, мы оценили важность перекрытия белков между протеомом спинномозговой жидкости и отдельными модулями мозга. Анализ показал, что в общей сложности 14 модулей мозга в наборе данных CSF имеют статистически значимое перекрытие (скорректированное FDR P <0,05), а также дополнительный модуль (M18), перекрытие которого близко к значимому (скорректированное FDR P = 0,06) (рис. 4C). , верхний ряд). Нас также интересуют модули, которые сильно перекрываются с дифференциально экспрессируемыми белками CSF. Поэтому мы применили два дополнительных анализа FET, чтобы определить, какой из (i) уровень белка CSF значительно увеличился при AD и (ii) уровень белка CSF был значительно снижен при AD (P <0,05, парный t-тест AD/контроль) Модули мозга со значимым перекрытием между ними. Как показано в среднем и нижнем рядах рисунка 4C, эти дополнительные анализы показывают, что 8 из 44 модулей мозга значительно перекрываются с белком, добавленным в AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 и M38). . ), тогда как только два модуля (M6 и M15) показали значимое перекрытие с восстановленным белком в AD CSF. Как и ожидалось, все 10 модулей входят в число 15 модулей с наибольшим перекрытием с протеомом CSF. Таким образом, мы предполагаем, что эти 15 модулей являются высокопроизводительными источниками биомаркеров спинномозговой жидкости головного мозга при болезни Альцгеймера.
Мы сложили эти 15 перекрывающихся модулей в пять больших белковых панелей на основании их близости на древовидной диаграмме WGCNA и их связи с типами клеток и онтологией генов (рис. 4D). Первая панель содержит модули, богатые маркерами нейронов и белками, связанными с синапсами (M1 и M12). Синаптическая панель содержит в общей сложности 94 белка, а уровни протеома спинномозговой жидкости значительно изменились, что делает его крупнейшим источником маркеров спинномозговой жидкости, связанных с мозгом, среди пяти панелей. Вторая группа (М6 и М15) продемонстрировала тесную связь с маркерами эндотелиальных клеток и сосудистым телом, такими как «заживление ран» (М6) и «регуляция гуморального иммунного ответа» (М15). M15 также тесно связан с метаболизмом липопротеинов, который тесно связан с эндотелием (36). Сосудистая панель содержит 34 маркера спинномозговой жидкости, связанных с мозгом. В третью группу входят модули (М2 и М4), которые значимо связаны с маркерами олигодендроцитов и пролиферацией клеток. Например, термины онтологии верхнего уровня M2 включают «позитивную регуляцию репликации ДНК» и «процесс биосинтеза пуринов». Между тем, те из M4 включают «дифференцировку глиальных клеток» и «расщепление хромосом». Панель миелинизации содержит 49 маркеров спинномозговой жидкости, связанных с мозгом.
Четвертая группа содержит наибольшее количество модулей (М30, М29, М18, М24 и М5), причем почти все модули значительно богаты маркерами микроглии и астроцитов. Подобно панели миелинизации, четвертая панель также содержит модули (M30, M29 и M18), которые тесно связаны с пролиферацией клеток. Остальные модули этой группы тесно связаны с иммунологическими терминами, такими как «процесс иммунного эффекта» (М5) и «регуляция иммунного ответа» (М24). Глиальная иммунная группа содержит 42 маркера спинномозговой жидкости, связанных с мозгом. Наконец, последняя панель включает 52 маркера, связанных с мозгом, в четырех модулях (M44, M3, M33 и M38), каждый из которых находится в организме и связан с накоплением энергии и метаболизмом. Самый крупный из этих модулей (М3) тесно связан с митохондриями и богат нейрон-специфическими маркерами. M38 является одним из меньших членов модуля в этом метаболоме и также демонстрирует умеренную нейронную специфичность.
В целом, эти пять панелей отражают широкий спектр типов клеток и функций в коре AD и в совокупности содержат 271 маркер CSF, связанный с мозгом (таблица S2G). Чтобы оценить достоверность этих результатов МС, мы использовали анализ расширения близости (PEA), технологию на основе ортогональных антител с возможностями мультиплексирования, высокой чувствительностью и специфичностью, и повторно проанализировали образцы спинномозговой жидкости, которые мы обнаружили. Подмножество этих 271 биомаркеров. (п = 36). Эти 36 целей демонстрируют изменение коэффициента AD для PEA, которое тесно связано с нашими результатами, полученными на основе МС (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), что убедительно подтверждает результаты нашего комплексного анализа МС (рис. S4). ).
Биологические темы, на которые обращают внимание наши пять групп, от синаптической передачи сигналов до энергетического метаболизма, связаны с патогенезом AD (1-3). Таким образом, все 15 модулей, содержащих эти панели, связаны с обнаруженной нами патологией AD в протеоме мозга (рис. 2B). Наиболее примечательной является высокая положительная патологическая корреляция между нашими глиальными модулями и сильная отрицательная патологическая корреляция между нашими крупнейшими нейронными модулями (M1 и M3). Анализ дифференциальной экспрессии нашего реплицированного протеома головного мозга (рис. S3D) также выявляет глиальные белки, происходящие из M5 и M18. При AsymAD и симптоматической AD наиболее повышены глиальные белки и синапсы, связанные с M1. Белок снижается больше всего. Эти наблюдения показывают, что 271 маркер спинномозговой жидкости, выявленный нами в пяти группах, связан с болезненными процессами в коре БА, включая те, которые возникают на ранних бессимптомных стадиях.
Чтобы лучше проанализировать направление изменения панельных белков в мозге и спинномозговой жидкости, мы нарисовали следующее для каждого из 15 перекрывающихся модулей: (i) нашли уровень распространенности модуля в наборе данных мозга и (ii) модуль белок Разница выражена в спинномозговой жидкости (рис. S5). Как упоминалось ранее, WGCNA используется для определения количества модулей или характеристического значения белка в мозге (13). Карта вулкана используется для описания дифференциальной экспрессии модульных белков в спинномозговой жидкости (AD/контроль). Эти цифры показывают, что три из пяти панелей демонстрируют различные тенденции экспрессии в мозговой и спинномозговой жидкости. Два модуля панели синапсов (M1 и M12) показывают снижение уровня содержания в мозге AD, но значительно перекрываются с повышенным содержанием белка в CSF AD (рис. S5A). Модули, связанные с нейронами, содержащие метаболом (M3 и M38), показали схожие и противоречивые паттерны экспрессии в мозге и спинномозговой жидкости (рис. S5E). Сосудистая панель также демонстрировала различные тенденции экспрессии, хотя ее модули (M6 и M15) были умеренно увеличены в головном мозге с AD и снижены в пораженной спинномозговой жидкости (рис. S5B). Остальные две панели содержат крупные глиальные сети, белки которых последовательно активируются в обоих компартментах (рис. S5, C и D).
Обратите внимание, что эти тенденции не являются общими для всех маркеров на этих панелях. Например, синаптическая панель включает несколько белков, уровень которых значительно снижается в мозге при AD и спинномозговой жидкости (рис. S5A). Среди этих маркеров спинномозговой жидкости с пониженной регуляцией являются NPTX2 и VGF M1, а также хромогранин B M12. Однако, несмотря на эти исключения, большинство наших синаптических маркеров повышены в спинномозговой жидкости при болезни Альцгеймера. В целом, эти анализы позволили выделить статистически значимые тенденции в уровнях мозговой и спинномозговой жидкости в каждой из наших пяти панелей. Эти тенденции подчеркивают сложную и часто различную взаимосвязь между экспрессией белков мозга и спинномозговой жидкости при AD.
Затем мы использовали высокопроизводительный анализ репликации MS (репликация CSF 1), чтобы сузить наш 271 набор биомаркеров до наиболее перспективных и воспроизводимых целей (рис. 5A). Копия 1 CSF содержит в общей сложности 96 образцов из Emory Goizueta ADRC, включая контрольную группу, группу AsymAD и AD (таблица S1A). Эти случаи БА характеризуются легким снижением когнитивных функций (средний показатель MoCA 20,0 ± 3,8) и изменениями биомаркеров АД, подтвержденными в спинномозговой жидкости (таблица S1A). В отличие от анализа спинномозговой жидкости, который мы обнаружили, эта репликация выполняется с использованием более эффективного и высокопроизводительного «однократного» метода МС (без автономного фракционирования), включая упрощенный протокол подготовки проб, который устраняет необходимость иммуноистощения отдельных образцов. . Вместо этого для усиления сигнала менее распространенных белков используется один ослабленный иммунитетом «канал усиления» (37). Хотя этот однократный метод уменьшает общее покрытие протеома, он значительно сокращает машинное время и увеличивает количество меченных ТМТ образцов, которые можно проанализировать как жизнеспособные (17, 38). Всего анализ выявил 6487 пептидов, которые в 96 случаях картировались с 1183 протеомами. Как и в случае с анализом спинномозговой жидкости, мы обнаружили, что в последующие расчеты были включены только те белки, количественно выраженные как минимум в 50% образцов, а данные подвергались регрессии с учетом влияния возраста и пола. Это привело к окончательной количественной оценке 792 протеомов, 95% из которых также были идентифицированы в найденном наборе данных CSF.
(A) Целевые белки спинномозговой жидкости, связанные с мозгом, проверенные в первой реплицированной когорте спинномозговой жидкости и включенные в окончательную панель (n = 60). (B–E) Панельные уровни биомаркеров (составные z-показатели), измеренные в четырех когортах репликации CSF. Парные t-критерии или ANOVA с пост-коррекцией Тьюки использовались для оценки статистической значимости изменений численности в каждом повторном анализе. КТ, контроль.
Поскольку мы особенно заинтересованы в проверке нашей 271 мишени CSF, связанной с мозгом, посредством всестороннего анализа, мы ограничим дальнейшее изучение этого реплицированного протеома этими маркерами. Среди этих 271 белка 100 были обнаружены в репликации 1 CSF. На рисунке S6A показана дифференциальная экспрессия этих 100 перекрывающихся маркеров между контрольными образцами репликации и AD. Синаптические и метаболитные гистоны больше всего увеличиваются при БА, тогда как сосудистые белки уменьшаются больше всего при заболевании. Большинство из 100 перекрывающихся маркеров (n = 70) сохраняли одинаковое направление изменений в двух наборах данных (рис. S6B). Эти 70 подтвержденных маркеров спинномозговой жидкости, связанных с мозгом (таблица S2H), в значительной степени отражают наблюдавшиеся ранее тенденции экспрессии панели, то есть понижение уровня сосудистых белков и повышение уровня всех других панелей. Только 10 из этих 70 проверенных белков показали изменения в распространенности AD, которые противоречили этим тенденциям панели. Чтобы создать панель, которая лучше всего отражает общую тенденцию состояния мозга и спинномозговой жидкости, мы исключили эти 10 белков из интересующей панели, которую мы окончательно проверили (рис. 5А). Таким образом, наша панель в конечном итоге включает в себя в общей сложности 60 белков, проверенных в двух независимых группах CSF AD с использованием различной подготовки образцов и анализа платформы MS. Графики экспрессии z-показателей этих окончательных панелей в контрольной копии 1 CSF и в случаях AD подтвердили тенденцию панели, наблюдаемую в обнаруженной нами когорте CSF (рис. 5B).
Среди этих 60 белков есть молекулы, которые, как известно, связаны с БА, такие как остеопонтин (SPP1), который является провоспалительным цитокином, который во многих исследованиях был связан с АД (39-41), и GAP43, синаптический белок. это явно связано с нейродегенерацией (42). Наиболее полно проверенными белками являются маркеры, связанные с другими нейродегенеративными заболеваниями, такими как супероксиддисмутаза 1 (SOD1), связанная с боковым амиотрофическим склерозом (ALS), и десахараза, связанная с болезнью Паркинсона (PARK7). Мы также подтвердили, что многие другие маркеры, такие как SMOC1 и богатый мозгом сигнальный белок 1 прикрепления к мембране (BASP1), ранее ограничивали связь с нейродегенерацией. Стоит отметить, что из-за их низкой общей численности в протеоме спинномозговой жидкости нам трудно использовать этот высокопроизводительный метод однократного обнаружения для надежного обнаружения MAPT и некоторых других белков, связанных с AD (например, NEFL и NRGN). ) (43, 44).
Затем мы проверили эти 60 маркеров панели приоритетов в трех дополнительных повторных анализах. В копии 2 CSF мы использовали одну TMT-MS для анализа независимой когорты из 297 контрольных образцов и образцов AD от Emory Goizueta ADRC (17). Репликация CSF 3 включала повторный анализ доступных данных TMT-MS от 120 пациентов из контрольной группы и пациентов с АД из Лозанны, Швейцария (45). Мы обнаружили более двух третей из 60 приоритетных маркеров в каждом наборе данных. Хотя в швейцарском исследовании использовались разные платформы MS и методы количественной оценки TMT (45, 46), мы четко воспроизвели тенденции наших групп в двух повторных анализах (рис. 5, C и D, а также таблицы S2, I и J). Чтобы оценить специфичность заболевания в нашей группе, мы использовали TMT-MS для анализа четвертого набора данных репликации (репликация СМЖ 4), который включал не только контрольные (n = 18) и случаи AD (n = 17), но также БП (n = 17). n = 14)), БАС (n = 18) и образцы лобно-височной деменции (ЛВД) (n = 11) (таблица S1A). Мы успешно определили количественно почти две трети белков панели в этой когорте (38 из 60). Эти результаты подчеркивают специфичные для AD изменения во всех пяти панелях биомаркеров (рис. 5E и таблица S2K). Увеличение группы метаболитов показало самую сильную специфичность AD, за ней следовали группа миелинизации и глии. В меньшей степени FTD также показывает увеличение между этими панелями, что может отражать аналогичные потенциальные изменения в сети (17). Напротив, БАС и БП показали почти такие же профили миелинизации, глии и метаболома, что и контрольная группа. В целом, несмотря на различия в подготовке образцов, платформе МС и методах количественного определения ТМТ, эти повторные анализы показывают, что наши приоритетные маркеры панели имеют очень последовательные изменения, специфичные для AD, в более чем 500 уникальных образцах спинномозговой жидкости.
Нейродегенерация БА была широко признана за несколько лет до появления когнитивных симптомов, поэтому существует острая потребность в биомаркерах AsymAD (5, 31). Однако все больше и больше данных показывают, что биология AsymAD далеко не однородна, а сложное взаимодействие риска и устойчивости приводит к большим индивидуальным различиям в последующем прогрессировании заболевания (47). Несмотря на то, что уровни основных биомаркеров спинномозговой жидкости (Aβ1-42, общий тау и p-тау) используются для выявления случаев AsymAD, не доказано, что они способны надежно предсказать, у кого будет прогрессировать деменция (4, 7), что указывает на большее. необходимо включить целостные инструменты биомаркеров, основанные на нескольких аспектах физиологии мозга, чтобы точно стратифицировать риск в этой группе населения. Поэтому мы впоследствии проанализировали нашу подтвержденную AD панель биомаркеров в популяции AsymAD копии 1 спинномозговой жидкости. В этих 31 случае AsymAD наблюдались аномальные уровни основных биомаркеров (соотношение Aβ1–42/общее тау ELISA, <5,5) и полная когнитивная способность (среднее значение MoCA, 27,1). ± 2,2) (таблица S1A). Кроме того, у всех людей с AsymAD показатель клинической деменции равен 0, что указывает на отсутствие признаков снижения ежедневных когнитивных или функциональных показателей.
Сначала мы проанализировали уровни проверенных панелей во всех 96 повторах СМЖ 1, включая когорту AsymAD. Мы обнаружили, что на нескольких панелях в группе AsymAD наблюдались значительные изменения численности, подобные AD, на сосудистой панели наблюдалась тенденция к снижению AsymAD, тогда как на всех других панелях наблюдалась тенденция к увеличению (рис. 6A). Таким образом, все панели показали весьма значимую корреляцию с ELISA Aβ1-42 и общими уровнями тау (рис. 6B). Напротив, корреляция между группой и оценкой MoCA относительно плохая. Одним из наиболее поразительных результатов этого анализа является широкий диапазон численности панелей в когорте AsymAD. Как показано на рисунке 6А, уровень панели группы AsymAD обычно пересекает уровень панели контрольной группы и группы AD, демонстрируя относительно высокую вариабельность. Для дальнейшего изучения этой гетерогенности AsymAD мы применили анализ многомерного масштабирования (MDS) к 96 случаям репликации 1 CSF. MDS-анализ позволяет визуализировать сходство между случаями на основе определенных переменных в наборе данных. Для этого кластерного анализа мы используем только те проверенные панельные маркеры, которые имеют статистически значимое изменение (P <0,05, AD/контроль) на уровне протеома обнаружения и репликации 1 CSF (n = 29) (таблица S2L). Этот анализ позволил выявить четкую пространственную кластеризацию между нашими контрольными случаями и случаями AD (рис. 6C). Напротив, некоторые случаи AsymAD четко группируются в контрольной группе, тогда как другие относятся к случаям AD. Для дальнейшего изучения этой неоднородности AsymAD мы использовали нашу карту MDS, чтобы определить две группы этих случаев AsymAD. В первую группу вошли случаи АсимАД, сгруппированные ближе к контролю (n = 19), тогда как во второй группе были отмечены случаи АсимАД с профилем маркеров, близким к БА (n = 12).
(A) Уровень экспрессии (z-показатель) группы биомаркеров CSF во всех 96 образцах в когорте репликации 1 CSF, включая AsymAD. Дисперсионный анализ с пост-коррекцией Тьюки использовался для оценки статистической значимости изменений численности панели. (B) Корреляционный анализ уровня содержания панельного белка (z-показатель) с показателем MoCA и общим уровнем тау в образцах ELISA Aβ1-42 и копии 1 CSF. Отображается коэффициент корреляции Пирсона с соответствующим значением P. (C) MDS 96 случаев копии 1 CSF был основан на уровнях распространенности 29 проверенных маркеров панели, которые были значительно изменены как в наборах данных открытия, так и в наборах данных копии 1 CSF [P <0,05 AD/контроль (CT)]. Этот анализ был использован для разделения группы AsymAD на контрольную (n = 19) и AD (n = 12) подгруппы. (D) График вулкана показывает дифференциальную экспрессию всех белков репликации 1 CSF с кратным изменением log2 (ось x) относительно статистического значения P -log10 между двумя подгруппами AsymAD. Панельные биомаркеры окрашены в цвет. (E) Уровень распространенности репликации 1 CSF биомаркеров группы отбора дифференциально выражен между подгруппами AsymAD. Для оценки статистической значимости использовался пост-корректированный дисперсионный анализ Тьюки.
Мы исследовали дифференциальную экспрессию белка между этими контрольными и AD-подобными случаями AsymAD (рис. 6D и таблица S2L). Полученная карта вулканов показывает, что 14 маркеров панели значительно изменились между двумя группами. Большинство этих маркеров являются членами синапса и метаболома. Однако к этой группе также принадлежат SOD1 и миристоилированный богатый аланином субстрат протеинкиназы C (MARCKS), которые являются членами миелиновой и глиальной иммунных групп соответственно (рис. 6, D и E). Сосудистая панель также выявила два маркера, уровень которых был значительно снижен в группе AD-подобных AsymAD, включая AE-связывающий белок 1 (AEBP1) и член семейства комплемента C9. Не было значительной разницы между контрольной и AD-подобной подгруппами AsymAD в ИФА AB1-42 (P = 0,38) и p-tau (P = 0,28), но действительно существовала значительная разница в общем уровне тау (P = 0,0031) ) (Рис. S7). Есть несколько маркеров панели, которые указывают на то, что изменения между двумя подгруппами AsymAD более значительны, чем общие уровни тау (например, YWHAZ, SOD1 и MDH1) (рис. 6E). В целом, эти результаты показывают, что наша проверенная панель может содержать биомаркеры, которые позволяют подтипировать и потенциально стратифицировать риск пациентов с бессимптомным заболеванием.
Существует острая необходимость в системных биомаркерных инструментах для лучшего измерения и определения различных патофизиологических процессов, лежащих в основе БА. Ожидается, что эти инструменты не только изменят нашу систему диагностики AD, но и будут способствовать принятию эффективных стратегий лечения, ориентированных на конкретного пациента (1, 2). С этой целью мы применили беспристрастный комплексный протеомный подход к мозгу и спинномозговой жидкости при болезни Альцгеймера, чтобы идентифицировать веб-биомаркеры спинномозговой жидкости, которые отражают широкий спектр патофизиологии мозга. Наш анализ позволил получить пять панелей биомаркеров спинномозговой жидкости, которые (i) отражают синапсы, кровеносные сосуды, миелин, иммунную и метаболическую дисфункцию; (ii) продемонстрировать высокую воспроизводимость на различных платформах MS; (iii) Покажите прогрессивные изменения, специфичные для заболевания, на ранних и поздних стадиях БА. В целом, эти результаты представляют собой многообещающий шаг на пути к разработке разнообразных, надежных, веб-ориентированных инструментов биомаркеров для исследований и клинических применений AD.
Наши результаты демонстрируют высококонсервативную организацию протеома сети мозга при болезни Альцгеймера и подтверждают его использование в качестве основы для разработки системных биомаркеров. Наш анализ показывает, что два независимых набора данных TMT-MS, содержащие мозг AD и AsymAD, имеют сильную модульность. Эти результаты расширяют нашу предыдущую работу, демонстрируя сохранение мощных модулей более чем 2000 тканей головного мозга из множества независимых когорт в лобной, теменной и височной коре (17). Эта консенсусная сеть отражает различные изменения, связанные с заболеванием, наблюдаемые в текущих исследованиях, включая увеличение количества воспалительных модулей, богатых глией, и уменьшение модулей, богатых нейронами. Как и текущие исследования, эта крупномасштабная сеть также демонстрирует значительные модульные изменения в AsymAD, демонстрируя множество различных доклинических патофизиологий (17).
Однако в рамках этой высококонсервативной системной структуры существует более мелкозернистая биологическая гетерогенность, особенно среди людей на ранних стадиях БА. Наша панель биомаркеров способна отобразить две подгруппы AsymAD, которые демонстрируют значительную дифференциальную экспрессию нескольких маркеров CSF. Наша группа смогла выделить биологические различия между этими двумя подгруппами, которые не были очевидны на уровне основных биомаркеров БА. По сравнению с контрольной группой, соотношение Aβ1-42/общее тау у этих людей с AsymAD было аномально низким. Однако между двумя подгруппами AsymAD значительно различались только общие уровни тау, в то время как уровни Aβ1-42 и p-tau оставались относительно сопоставимыми. Поскольку высокий уровень тау в спинномозговой жидкости, по-видимому, является лучшим предиктором когнитивных симптомов, чем уровни Aβ1-42 (7), мы подозреваем, что две когорты AsymAD могут иметь разные риски прогрессирования заболевания. Учитывая ограниченный размер выборки нашего AsymAD и отсутствие продольных данных, необходимы дальнейшие исследования, чтобы с уверенностью сделать эти выводы. Однако эти результаты показывают, что системная панель CSF может улучшить нашу способность эффективно стратифицировать людей на бессимптомной стадии заболевания.
В целом, наши результаты подтверждают роль множества биологических функций в патогенезе БА. Тем не менее, нарушение регуляции энергетического метаболизма стало главной темой всех наших пяти утвержденных комиссий по маркировке. Метаболические белки, такие как гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза 1 (HPRT1) и лактатдегидрогеназа A (LDHA), являются наиболее достоверно подтвержденными синаптическими биомаркерами, что указывает на то, что увеличение AD CSF является высоко воспроизводимым полом. Наши кровеносные сосуды и глиальные панели также содержат несколько маркеров, участвующих в метаболизме окислительных веществ. Эти данные согласуются с ключевой ролью, которую метаболические процессы играют во всем мозге не только для удовлетворения высоких энергетических потребностей нейронов, но также для удовлетворения высоких энергетических потребностей астроцитов и других глиальных клеток (17, 48). Наши результаты подтверждают растущее количество доказательств того, что изменения окислительно-восстановительного потенциала и прерывание энергетических путей могут быть основным связующим звеном между несколькими ключевыми процессами, участвующими в патогенезе БА, включая митохондриальные нарушения, глиально-опосредованное воспаление и повреждение сосудов (49). Кроме того, метаболические биомаркеры спинномозговой жидкости содержат большое количество белков, по-разному богатых между нашей контрольной и AD-подобной подгруппами AsymAD, что позволяет предположить, что нарушение этих энергетических и окислительно-восстановительных путей может иметь решающее значение на доклинической стадии заболевания.
Различные тенденции в панелях головного мозга и спинномозговой жидкости, которые мы наблюдали, также имеют интересные биологические последствия. Синапсы и метаболомы, богатые нейронами, демонстрируют снижение уровней в головном мозге с болезнью Альцгеймера и повышенное содержание в спинномозговой жидкости. Учитывая, что нейроны богаты производящими энергию митохондриями в синапсах, обеспечивающими энергию для их многочисленных специализированных сигналов (50), ожидается сходство профилей экспрессии этих двух групп нейронов. Потеря нейронов и вытеснение поврежденных клеток могут объяснить эти тенденции в панелях головного мозга и спинномозговой жидкости при более поздних стадиях заболевания, но они не могут объяснить наблюдаемые нами ранние изменения в панелях (13). Одним из возможных объяснений этих результатов на ранних стадиях бессимптомного заболевания является аномальное сокращение синапсов. Новые данные на моделях мышей позволяют предположить, что опосредованный микроглией синаптический фагоцитоз может аномально активироваться при БА и приводить к ранней потере синапсов в головном мозге (51). Этот отброшенный синаптический материал может накапливаться в СМЖ, поэтому мы наблюдаем увеличение СМЖ на панели нейронов. Иммуноопосредованное сокращение синапсов также может частично объяснить увеличение количества глиальных белков, которое мы наблюдаем в мозге и спинномозговой жидкости на протяжении всего процесса заболевания. Помимо синаптической обрезки, общие аномалии экзоцитарного пути могут также приводить к различной экспрессии нейрональных маркеров в мозге и спинномозговой жидкости. Ряд исследований показал, что содержание экзосом в патогенезе болезни Альцгеймера изменилось (52). Внеклеточный путь также участвует в пролиферации Aβ (53, 54). Стоит отметить, что подавление секреции экзосом может уменьшить БА-подобную патологию на моделях трансгенных мышей с БА (55).
В то же время белок в сосудистой панели показал умеренное увеличение в АД головного мозга, но значительно снизился в ликворе. Дисфункция гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) может частично объяснить эти результаты. Многие независимые посмертные исследования на людях продемонстрировали разрушение ГЭБ при БА (56, 57). Эти исследования подтвердили различные аномальные активности вокруг этого плотно закрытого слоя эндотелиальных клеток, включая утечку из капилляров головного мозга и периваскулярное накопление белков, переносимых кровью (57). Это может дать простое объяснение повышенному содержанию сосудистых белков в головном мозге, но не может полностью объяснить истощение этих же белков в спинномозговой жидкости. Одна из возможностей заключается в том, что центральная нервная система активно изолирует эти молекулы, чтобы решить проблему усиления воспаления и окислительного стресса. Снижение содержания некоторых из наиболее тяжелых белков ЦСЖ на этой панели, особенно тех, которые участвуют в регуляции липопротеинов, связано с ингибированием вредных уровней воспаления и нейрозащитного процесса активных форм кислорода. Это справедливо для пароксоназы 1 (PON1), фермента, связывающего липопротеины, ответственного за снижение уровня окислительного стресса в кровообращении (58, 59). Предшественник альфа-1-микроглобулина/бикунина (AMBP) является еще одним значительно сниженным маркером сосудистой группы. Это предшественник транспортера липидов бикунина, который также участвует в подавлении воспаления и неврологической защите (60, 61).
Несмотря на различные интересные гипотезы, неспособность напрямую обнаружить биохимические механизмы заболеваний является хорошо известным ограничением протеомного анализа, основанного на открытиях. Следовательно, необходимы дальнейшие исследования, чтобы уверенно определить механизмы, лежащие в основе этих панелей биомаркеров. Чтобы двигаться к развитию клинического анализа на основе рассеянного склероза, будущее направление также требует использования целевых количественных методов для крупномасштабной проверки биомаркеров, таких как селективный или параллельный мониторинг реакций (62). Недавно мы использовали мониторинг параллельных реакций (63) для подтверждения многих описанных здесь изменений белка спинномозговой жидкости. Несколько приоритетных групповых целей определены количественно со значительной точностью, включая YWHAZ, ALDOA и SMOC1, которые соответствуют нашим панелям синапсов, метаболизма и воспаления соответственно (63). Независимый сбор данных (DIA) и другие стратегии на основе MS также могут быть полезны для целевой проверки. Бад и др. (64) Недавно было продемонстрировано, что существует значительное совпадение между биомаркерами AD, выявленными в нашем наборе данных обнаружения CSF и независимом наборе данных DIA-MS, который состоит из почти 200 образцов CSF из трех разных европейских когорт. Эти недавние исследования подтверждают потенциал наших панелей для надежного обнаружения на основе МС. Традиционное обнаружение на основе антител и аптамеров также важно для дальнейшей разработки ключевых биомаркеров AD. Из-за низкой распространенности спинномозговой жидкости эти биомаркеры труднее обнаружить с помощью высокопроизводительных методов МС. NEFL и NRGN являются двумя такими примерами биомаркеров спинномозговой жидкости с низким содержанием, которые отображены на панели в нашем комплексном анализе, но не могут быть надежно обнаружены с помощью нашей единой стратегии MS. Стратегии нацеливания, основанные на использовании нескольких антител, таких как ПЭА, могут способствовать клинической трансформации этих маркеров.
В целом, это исследование обеспечивает уникальный протеомный подход для идентификации и проверки биомаркеров AD в спинномозговой жидкости на основе различных систем. Оптимизация этих панелей маркеров для дополнительных когорт БА и платформ РС может оказаться многообещающей для улучшения стратификации и лечения риска БА. Исследования, которые оценивают продольный уровень этих панелей с течением времени, также имеют решающее значение для определения того, какая комбинация маркеров лучше всего стратифицирует риск раннего заболевания и изменения тяжести заболевания.
За исключением трех образцов, скопированных CSF, все образцы CSF, использованные в этом исследовании, были собраны под эгидой Emory ADRC или тесно связанных с ним исследовательских учреждений. В этих протеомных исследованиях использовали в общей сложности четыре набора образцов спинномозговой жидкости Эмори. Было обнаружено, что когорта CSF содержит образцы от 20 здоровых людей из контрольной группы и 20 пациентов с AD. Копия 1 CSF включает образцы от 32 здоровых людей из контрольной группы, 31 человека с AsymAD и 33 пациентов с AD. Копия 2 CSF содержит 147 контролей и 150 образцов AD. Группа репликации 4 спинномозговой жидкости с несколькими заболеваниями включала 18 образцов контроля, 17 образцов AD, 19 ALS, 13 PD и 11 образцов FTD. В соответствии с соглашением, одобренным Институциональным наблюдательным советом Университета Эмори, все участники исследования Эмори получили информированное согласие. В соответствии с рекомендациями Национального института старения для центров лечения болезни Альцгеймера от 2014 года (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html), спинномозговую жидкость собирали и хранили посредством люмбальной пункции. Пациенты контрольной группы, а также пациенты с AsymAD и AD прошли стандартизированную когнитивную оценку в клинике когнитивной неврологии Эмори или Goizueta ADRC. Их образцы спинномозговой жидкости были протестированы с помощью INNO-BIA AlzBio3 Luminex на предмет ELISA Aβ1-42, анализа общего тау и p-тау (65). Значения ELISA используются для поддержки диагностической классификации субъектов на основе установленных критериев отсечения биомаркеров AD (66, 67). Основные демографические и диагностические данные для других диагнозов ЦСЖ (ЛВД, БАС и БП) также получают от Emory ADRC или дочерних исследовательских учреждений. Сводные метаданные по этим случаям Emory CSF можно найти в Таблице S1A. Характеристики швейцарской когорты репликации CSF 3 были опубликованы ранее (45).
CSF нашел образец. Чтобы увеличить глубину нашего открытия набора данных CSF, перед трипсинизацией было проведено иммунное потребление белков с высоким содержанием. Короче говоря, 130 мкл спинномозговой жидкости из 40 отдельных образцов спинномозговой жидкости и равный объем (130 мкл) смолы High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) были помещены в центрифужную колонку (Thermo Fisher Scientific, A89868) при комнатной температуре. температура Инкубировать). После вращения в течение 15 минут центрифугируйте образец при 1000 g в течение 2 минут. Ультрацентробежное фильтрующее устройство 3K (Millipore, UFC500396) использовали для концентрирования образца стоков путем центрифугирования при 14 000 g в течение 30 минут. Разбавьте все объемы образцов до 75 мкл физиологическим раствором с фосфатным буфером. Концентрацию белка оценивали методом бицинхониновой кислоты (BCA) по протоколу производителя (Thermo Fisher Scientific). Иммуноистощенный СМЖ (60 мкл) из всех 40 образцов расщепляли лизилэндопептидазой (LysC) и трипсином. Короче говоря, образец восстанавливали и алкилировали 1,2 мкл 0,5 М трис-2(-карбоксиэтил)фосфина и 3 мкл 0,8 М хлорацетамида при 90°C в течение 10 минут, а затем обрабатывали ультразвуком на водяной бане в течение 15 минут. Образец разбавляли 193 мкл 8 М мочевинного буфера [8 М мочевины и 100 мМ NaHPO4 (рН 8,5)] до конечной концентрации 6 М мочевины. LysC (4,5 мкг; Wako) используют для расщепления в течение ночи при комнатной температуре. Затем образец разбавляли до 1 М мочевины 50 мМ бикарбоната аммония (ABC) (68). Добавьте равное количество (4,5 мкг) трипсина (Промега) и инкубируйте образец в течение 12 часов. Подкислите раствор переваренного пептида до конечной концентрации 1% муравьиной кислоты (FA) и 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) (66), а затем обессолите с помощью колонки Sep-Pak C18 (Waters) с концентрацией 50 мг, как описано выше (25). . Затем пептид элюировали 1 мл 50% ацетонитрила (ACN). Для стандартизации количественного определения белка в партиях (25) аликвоты по 100 мкл из всех 40 образцов спинномозговой жидкости были объединены для получения смешанного образца, который затем был разделен на пять образцов глобального внутреннего стандарта (GIS) (48). Все отдельные образцы и комбинированные стандарты сушат высокоскоростным вакуумом (Labconco).
CSF копирует образец. Дайон и его коллеги ранее описали иммунное истощение и переваривание образцов копии 3 спинномозговой жидкости (45, 46). Остальные повторные образцы не были индивидуально истощены по иммунитету. Переварите эти неудаленные образцы трипсином, как описано ранее (17). Для каждого повторного анализа аликвоты элюированного пептида из каждого образца по 120 мкл объединяли и делили на аликвоты равного объема для использования в качестве глобального внутреннего стандарта, меченного ТМТ (48). Все отдельные образцы и комбинированные стандарты сушат высокоскоростным вакуумом (Labconco). Чтобы усилить сигнал белка спинномозговой жидкости с низким содержанием, путем объединения 125 мкл каждого образца для каждого повторного анализа готовили «улучшенный» образец (т. е. биологический образец, который имитирует исследовательский образец, но доступное количество намного больше (37, 69)] слились в смешанную пробу ЦСЖ (17). Затем смешанный образец подвергали иммуноудалению с использованием 12 мл смолы для удаления белка High Select Top14 Abundance (Thermo Fisher Scientific, A36372), расщепляли, как описано выше, и включали в последующее многократное мечение ТМТ.
Время публикации: 27 августа 2021 г.