Благодарим вас за посещение Nature.com. Версия браузера, которую вы используете, имеет ограниченную поддержку CSS. Для оптимальной работы мы рекомендуем вам использовать обновленный браузер (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). Тем временем, чтобы обеспечить постоянную поддержку, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Термофилы – это микроорганизмы, которые процветают при высоких температурах. Их изучение может дать ценную информацию о том, как жизнь адаптируется к экстремальным условиям. Однако с помощью обычных оптических микроскопов трудно добиться высоких температурных условий. Было предложено несколько самодельных решений, основанных на локальном резистивном электрическом нагреве, но простого коммерческого решения не существует. В этой статье мы представляем концепцию микромасштабного лазерного нагрева в поле зрения микроскопа, чтобы обеспечить высокие температуры для исследований термофилов, сохраняя при этом мягкую окружающую среду пользователя. Микромасштабный нагрев при умеренной интенсивности лазера может быть достигнут с использованием подложки, покрытой наночастицами золота, в качестве биосовместимого и эффективного поглотителя света. Обсуждаются возможные эффекты микромасштабной конвекции жидкости, удержания клеток и центробежного термофоретического движения. Этот метод был продемонстрирован на двух видах: (i) Geobacillus stearothermophilus, активной термофильной бактерии, которая размножается при температуре около 65°C и которая, как мы наблюдали, прорастает, растет и плавает при микромасштабном нагревании; (ii) Thiobacillus sp., оптимально гипертермофильная архея. при 80°С. Эта работа открывает путь к простому и безопасному наблюдению за термофильными микроорганизмами с использованием современных и доступных инструментов микроскопии.
За миллиарды лет жизнь на Земле развивалась, приспосабливаясь к широкому спектру условий окружающей среды, которые с человеческой точки зрения иногда считаются экстремальными. В частности, некоторые термофильные микроорганизмы (бактерии, археи, грибы), называемые термофилами, процветают в диапазоне температур от 45°C до 122°C1, 2, 3, 4. Термофилы обитают в различных экосистемах, таких как глубоководные гидротермальные источники, горячие источники. или вулканические районы. Их исследования вызвали большой интерес за последние несколько десятилетий по крайней мере по двум причинам. Во-первых, мы можем узнать у них, например, как термофилы 5, 6, ферменты 7, 8 и мембраны 9 стабильны при таких высоких температурах или как термофилы могут противостоять экстремальным уровням радиации10. Во-вторых, они являются основой для многих важных биотехнологических применений1,11,12, таких как производство топлива13,14,15,16, химический синтез (дигидро, спирты, метан, аминокислоты и т.д.)17, биодобыча18 и термостабильные биокатализаторы7,11, 13. В частности, хорошо известная в настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР)19 включает фермент (Taq-полимеразу), выделенный из термофильной бактерии Thermus aquaticus, одной из первых открытых термофилов.
Однако изучение термофилов — задача непростая, и ее нельзя импровизировать в любой биологической лаборатории. В частности, живые термофилы невозможно наблюдать in vitro с помощью любого стандартного светового микроскопа, даже с помощью имеющихся в продаже нагревательных камер, обычно рассчитанных на температуру до 40°C. С 1990-х годов лишь несколько исследовательских групп посвятили себя внедрению систем высокотемпературной микроскопии (ВТМ). В 1994 г. Глух и др. Камера нагрева/охлаждения была разработана на основе использования ячейки Пельтье, которая контролирует температуру прямоугольных капилляров, закрытых для поддержания анаэробности 20 . Устройство можно нагревать до 100 °C со скоростью 2 °C/с, что позволяет авторам изучать подвижность гипертермофильной бактерии Thermotoga maritima21. В 1999 году Хорн и др. Было разработано очень похожее устройство, по-прежнему основанное на использовании нагретых капилляров, подходящих для коммерческой микроскопии для изучения деления/соединения клеток. После длительного периода относительного бездействия поиск эффективных НТМ возобновился в 2012 г., в частности, в связи с серией работ группы Вирта, в которых использовалось устройство, изобретенное Хорном и др. Пятнадцать лет назад подвижность большого количества архей, в том числе гипертермофилов, была изучена при температуре до 100°C с использованием нагретых капилляров23,24. Они также модифицировали оригинальный микроскоп, чтобы добиться более быстрого нагрева (несколько минут вместо 35 минут для достижения заданной температуры) и достижения линейного градиента температуры более 2 см поперек среды. Это устройство формирования температурного градиента (TGFD) использовалось для изучения подвижности многих термофилов в пределах температурных градиентов на биологически значимых расстояниях 24, 25 .
Нагревание закрытых капилляров — не единственный способ наблюдения за живыми термофилами. В 2012 году Кувабара и др. Использовали самодельные одноразовые камеры из пирекса, герметизированные термостойким клеем (Super X2; Cemedine, Япония). Образцы помещали на коммерчески доступную прозрачную нагревательную пластину (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Япония), способную нагреваться до 110°C, но изначально не предназначенную для биовизуализации. Авторы наблюдали эффективное деление анаэробных термофильных бактерий (Thermosipho globiformans, время удвоения 24 мин) при 65°С. В 2020 г. Пульшен и др. Эффективный нагрев коммерческих металлических чашек (AttofluorTM, Thermofisher) был продемонстрирован с использованием двух самодельных нагревательных элементов: крышки и предметного столика (конфигурация, напоминающая машину ПЦР). Эта ассоциация приводит к равномерной температуре жидкости и предотвращает испарение и конденсацию в нижней части крышки. Использование уплотнительного кольца позволяет избежать газообмена с окружающей средой. Этот HTM, названный сульфоскопом, использовался для получения изображений Sulfolobus acidocaldarius при 75°C27.
Признанным ограничением всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любая масляная иммерсия непригодна для такой высокой температуры и для получения изображений через прозрачные образцы толщиной> 1 мм. Признанным ограничением всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любая масляная иммерсия непригодна для такой высокой температуры и для получения изображений через прозрачные образцы толщиной> 1 мм. Общим недостатком всех этих признаний было системное ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любое иммерсионное погружение в масло не подходит для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные изображения толщиной > 1 мм. Признанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объективов, поскольку любая масляная иммерсия была непригодна для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачные образцы толщиной > 1 мм.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜，任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1毫米厚的透明样品成像。 Признанным ограничением всех этих систем является ограничение использования воздухововлекающего зеркала, поскольку любая масляная иммерсия непригодна для визуализации прозрачных образцов толщиной > 1 мм при таких высоких температурах. Общим недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объективов, любое иммерсионное погружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализация через прозрачные кристаллы толщиной >1 мм. Признанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных линз, любая масляная иммерсия непригодна для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы толщиной >1 мм.Совсем недавно это ограничение было снято Charles-Orzag et al. 28, которые разработали устройство, обеспечивающее нагрев уже не вокруг интересующей системы, а внутри самого покровного стекла, покрытого тонким прозрачным слоем резистора из ITO (оксид индия-олова). Крышку можно нагреть до 75 °C, пропуская электрический ток через прозрачный слой. Однако автору также необходимо нагреть объектив до температуры, но не более 65 °С, чтобы не повредить его.
Эти работы показывают, что разработка эффективной высокотемпературной оптической микроскопии не получила широкого распространения, часто требует самодельного оборудования и часто достигается за счет пространственного разрешения, что является серьезным недостатком, учитывая, что термофильные микроорганизмы размером не более нескольких единиц. микрометры. Уменьшение объема нагрева является ключом к решению трех присущих HTM проблем: плохого пространственного разрешения, высокой тепловой инерции при нагревании системы и вредного нагрева окружающих элементов (иммерсионного масла, объектива… или рук пользователя) при экстремальных температурах. ).
В этой статье мы представляем НТМ для наблюдения за термофилами, который не основан на резистивном нагреве. Вместо этого мы добились локализованного нагрева в ограниченной области поля зрения микроскопа за счет лазерного облучения светопоглощающей подложки. Распределение температуры визуализировали с помощью количественной фазовой микроскопии (КФМ). Эффективность этого метода демонстрируют Geobacillus stearothermophilus, подвижная термофильная бактерия, размножающаяся при температуре около 65°C и имеющая короткое время удвоения (около 20 минут), и Sulfolobus shibatae, гипертермофил, оптимально растущий при 80°C (археи). чтобы проиллюстрировать. Нормальную скорость репликации и плавание наблюдали в зависимости от температуры. Этот лазерный HTM (LA-HTM) не ограничен толщиной покровного стекла или характером объекта (воздушная или масляная иммерсия). Это позволяет использовать любой объектив высокого разрешения, имеющийся на рынке. Он также не страдает от медленного нагрева из-за тепловой инерции (достигает мгновенного нагрева в миллисекундном масштабе) и использует только коммерчески доступные компоненты. Единственные новые проблемы безопасности связаны с наличием мощных лазерных лучей (обычно до 100 мВт) внутри устройства и, возможно, через глаза, для чего требуются защитные очки.
Принцип LA-HTM заключается в использовании лазера для локального нагрева образца в поле зрения микроскопа (рис. 1а). Для этого образец должен быть светопоглощающим. Для использования разумной мощности лазера (менее 100 мВт) мы не полагались на поглощение света жидкой средой, а искусственно увеличивали поглощение образца, покрывая подложку наночастицами золота (рис. 1в). Нагревание наночастиц золота светом имеет фундаментальное значение для области термической плазмоники и может найти применение в биомедицине, нанохимии или сборе солнечного света29,30,31. За последние несколько лет мы использовали этот LA-HTM в нескольких исследованиях, связанных с применением тепловой плазмы в физике, химии и биологии. Основная трудность этого метода заключается в отображении окончательного профиля температуры, поскольку повышенная температура ограничена микромасштабной областью внутри образца. Мы показали, что картирование температуры может быть достигнуто с помощью четырехволнового интерферометра поперечного сдвига — простого, с высоким разрешением и очень чувствительного метода количественной фазовой микроскопии, основанного на использовании двумерных дифракционных решеток (также известных как перекрестные решетки). 33,34,35,36. Надежность этого метода термической микроскопии, основанного на микроскопии волнового фронта со скрещенными решетками (CGM), была продемонстрирована в десятке статей, опубликованных за последнее десятилетие37,38,39,40,41,42,43.
Схема установки параллельного лазерного нагревательного, формообразующего и температурного микроскопа. b Геометрия образца: камера AttofluorTM, содержащая покровное стекло, покрытое наночастицами золота. c Посмотрите внимательно на образец (не в масштабе). d представляет собой однородный профиль лазерного луча и (e) смоделированное последующее распределение температуры на плоскости образца наночастиц золота. f представляет собой кольцевой профиль лазерного луча, подходящий для создания однородной температуры, как показано при моделировании результирующего распределения температуры, показанного на (g). Масштабная линейка: 30 мкм.
В частности, недавно мы добились нагрева клеток млекопитающих с помощью LA-HTM и CGM и отследили клеточные реакции на тепловой шок в диапазоне 37-42°C, продемонстрировав применимость этого метода для визуализации одиночных живых клеток. Однако применение ЛА-НТМ для исследования микроорганизмов при высоких температурах не однозначно, так как требует большей осторожности по сравнению с клетками млекопитающих: во-первых, нагревание дна среды на десятки (а не на несколько градусов) градусов сильному вертикальному градиенту температуры. может создавать конвекцию жидкости 44, которая, если она не прочно прикреплена к подложке, может вызвать нежелательное перемещение и смешивание бактерий. Эту конвекцию можно устранить, уменьшив толщину слоя жидкости. Для этого во всех представленных ниже экспериментах бактериальные суспензии помещали между двумя покровными стеклами толщиной примерно 15 мкм, помещенными в металлическую чашку (AttofluorTM, Thermofisher, рис. 1б,в). В принципе, конвекции можно избежать, если толщина жидкости меньше размера луча нагревательного лазера. Во-вторых, работа в такой ограниченной геометрии может привести к удушению аэробных организмов (см. рис. S2). Этой проблемы можно избежать, используя подложку, проницаемую для кислорода (или любого другого жизненно важного газа), оставляя пузырьки воздуха внутри покровного стекла или просверливая отверстия в верхнем покровном стекле (см. рис. S1) 45 . В этом исследовании мы выбрали последнее решение (рис. 1b и S1). Наконец, лазерный нагрев не обеспечивает равномерного распределения температуры. Даже при одинаковой интенсивности лазерного луча (рис. 1г) распределение температуры не является равномерным, а напоминает распределение Гаусса за счет термодиффузии (рис. 1д). Когда целью является установление точных температур в поле зрения для изучения биологических систем, неравномерные профили не являются идеальными и могут также привести к термофоретическому движению бактерий, если они не прикрепляются к субстрату (см. рис. S3, S4)39. С этой целью мы использовали пространственный модулятор света (ПМС) для формирования инфракрасного лазерного луча по форме кольца (рис. 1е) в плоскости образца для достижения идеально равномерного распределения температуры в пределах заданной геометрической области. несмотря на термодиффузию (рис. 1d) 39, 42, 46. Поместите верхнее покровное стекло на металлическую чашку (рис. 1b), чтобы избежать испарения среды, и наблюдайте в течение как минимум нескольких дней. Поскольку верхнее покровное стекло не запечатано, при необходимости в любой момент можно легко добавить дополнительную среду.
Чтобы проиллюстрировать, как работает LA-HTM, и продемонстрировать его применимость в термофильных исследованиях, мы изучили аэробные бактерии Geobacillus stearothermophilus, оптимальная температура роста которых составляет около 60–65°C. У бактерии также есть жгутики и способность плавать, что является еще одним показателем нормальной клеточной активности.
Образцы (рис. 1б) предварительно инкубировали при 60°C в течение одного часа, а затем помещали в держатель образцов LA-HTM. Эта предварительная инкубация не является обязательной, но все же полезной по двум причинам: во-первых, когда лазер включен, он заставляет клетки немедленно расти и делиться (см. фильм M1 в дополнительных материалах). Без предварительной инкубации рост бактерий обычно задерживается примерно на 40 минут каждый раз, когда на образце нагревается новая область наблюдения. Во-вторых, предварительная инкубация в течение 1 часа способствовала адгезии бактерий к покровному стеклу, предотвращая выход клеток из поля зрения из-за термофореза при включении лазера (см. фильм М2 в дополнительных материалах). Термофорез – это движение частиц или молекул по градиенту температуры, обычно от горячего к холодному, и бактерии не являются исключением43,47. Этот нежелательный эффект устраняется на заданной площади за счет использования SLM для формирования лазерного луча и достижения плоского распределения температуры.
На рис. На рис. 2 показано распределение температуры, измеренное методом CGM, полученное при облучении стеклянной подложки, покрытой наночастицами золота, кольцевым лазерным лучом (рис. 1е). Наблюдалось ровное распределение температуры по всей площади, охватываемой лазерным лучом. Эта зона была установлена на 65°C, оптимальную температуру роста. Вне этой области температурная кривая естественным образом спадает до \(1/r\) (где \(r\) — радиальная координата).
Температурная карта измерений CGM, полученная с использованием кольцевого лазерного луча для облучения слоя наночастиц золота для получения плоского профиля температуры на круглой площади. б Изотерма температурной карты (а). Контур лазерного луча представлен серым пунктирным кружком. Эксперимент был повторен дважды (см. Дополнительные материалы, рисунок S4).
Жизнеспособность бактериальных клеток контролировали в течение нескольких часов с помощью LA-HTM. На рис. 3 показан временной интервал для четырех изображений, взятых из фильма продолжительностью 3 часа 20 минут (Фильм М3, Дополнительная информация). Было замечено, что бактерии активно размножаются в пределах круглой области, определяемой лазером, где температура была оптимальной, приближающейся к 65°C. Напротив, рост клеток значительно замедлялся, когда температура падала ниже 50°C в течение 10 с.
Изображения оптической глубины бактерий G. stearothermophilus, растущих после лазерного нагрева в разное время: а — t = 0 мин, б — 1 ч 10 мин, в — 2 ч 20 мин, г — 3 ч 20 мин, из 200 Извлечено из одноминутного фильма (фильм M3, представленный в разделе «Дополнительная информация»), наложенного на соответствующую температурную карту. Лазер включается в момент времени \(t=0\). К изображению интенсивности добавлены изотермы.
Для дальнейшей количественной оценки роста клеток и его зависимости от температуры мы измеряли увеличение биомассы различных колоний первоначально изолированных бактерий в поле зрения Movie M3 (рис. 4). Родительские бактерии, выбранные в начале формирования мини-колониеобразующей единицы (мКОЕ), показаны на рисунке S6. Измерения сухой массы проводились с помощью камеры CGM 48, которая использовалась для картирования распределения температуры. Способность CGM измерять сухой вес и температуру является сильной стороной LA-HTM. Как и ожидалось, высокая температура вызывала более быстрый рост бактерий (рис. 4а). Как показано на полулогарифмическом графике на рис. 4б, рост при всех температурах следует экспоненциальному росту, где в данных используется экспоненциальная функция \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), где \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – время генерации (или время удвоения), \( g =1/ \tau\) – скорость роста (количество делений в единицу времени). На рис. 4в показаны соответствующие скорость роста и время генерации в зависимости от температуры. Быстрорастущие мКОЕ характеризуются насыщением роста через два часа, что является ожидаемым поведением из-за высокой плотности бактерий (аналогично стационарной фазе в классических жидких культурах). Общая форма \(g\left(T\right)\) (рис. 4в) соответствует ожидаемой двухфазной кривой для G. stearothermophilus с оптимальной скоростью роста около 60-65°C. Сопоставьте данные, используя кардинальную модель (рис. S5)49, где \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °С, что хорошо согласуется с другими значениями, приведенными в литературе49. Хотя параметры, зависящие от температуры, воспроизводимы, максимальная скорость роста \({G}_{0}\) может варьироваться от одного эксперимента к другому (см. рисунки S7-S9 и фильм M4). В отличие от параметров подбора температуры, которые должны быть универсальными, максимальная скорость роста зависит от свойств среды (наличия питательных веществ, концентрации кислорода) в пределах наблюдаемой геометрии микромасштаба.
Рост микроорганизмов при различных температурах. мКОЕ: Миниатюрные колониеобразующие единицы. Данные получены из видео, на котором одна бактерия растет в температурном градиенте (фильм М3). б То же, что (а), полулогарифмический масштаб. c Скорость роста\(\tau\) и время генерации\(g\) рассчитаны на основе линейной регрессии (b). Горизонтальные полосы ошибок: диапазон температур, в котором мКОЕ расширяются в поле зрения во время роста. Столбики вертикальных ошибок: стандартная ошибка линейной регрессии.
Помимо нормального роста, некоторые бактерии иногда появлялись в поле зрения во время лазерного нагрева, что является ожидаемым поведением для бактерий со жгутиками. В фильме М5 в дополнительной информации показаны такие занятия плаванием. В этом эксперименте однородное лазерное излучение использовалось для создания температурного градиента, как показано на рисунках 1d, e и S3. На рисунке 5 показаны две последовательности изображений, выбранные из фильма M5, показывающие, что одна бактерия демонстрирует направленное движение, в то время как все остальные бактерии остаются неподвижными.
Два временных интервала (а) и (б) показывают плавание двух разных бактерий, отмеченных пунктирными кружками. Изображения были взяты из фильма M5 (предоставлены в качестве дополнительного материала).
В случае G. stearothermophilus активное движение бактерий (рис. 5) начиналось через несколько секунд после включения лазерного луча. Это наблюдение подчеркивает временную реакцию этого термофильного микроорганизма на повышение температуры, как уже наблюдали Мора и др. 24 . Тему подвижности бактерий и даже термотаксиса можно дополнительно изучить с помощью LA-HTM.
Плавание микробов не следует путать с другими типами физического движения, а именно (i) броуновским движением, которое выглядит как хаотическое движение без определенного направления, (ii) конвекцией 50 и термофорезом 43, состоящими в регулярном дрейфе движения вдоль температуры. градиент.
G. stearothermophilus известен своей способностью производить высокоустойчивые споры (спорообразование) при воздействии неблагоприятных условий окружающей среды в качестве защиты. Когда условия окружающей среды снова становятся благоприятными, споры прорастают, образуя живые клетки и возобновляя рост. Хотя этот процесс споруляции/прорастания хорошо известен, его никогда не наблюдали в реальном времени. Используя LA-HTM, мы сообщаем здесь о первом наблюдении событий прорастания у G. stearothermophilus.
На рис. 6а показаны покадровые изображения оптической глубины (ОТ), полученные с использованием набора CGM из 13 спор. За все время сбора (15 ч 6 мин, \(t=0\) – начало лазерного нагрева) из 13 спор проросло 4, в последовательные моменты времени \(t=2\) ч, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' и \(11\) h \(30\)'. Хотя на рисунке 6 показано только одно из этих событий, в фильме М6 в дополнительном материале можно наблюдать 4 события прорастания. Интересно, что прорастание оказывается случайным: не все споры прорастают и не прорастают одновременно, несмотря на одинаковые изменения условий окружающей среды.
a Промежуток времени, состоящий из 8 ОТ-изображений (масляная иммерсия, 60x, объектив с числовой апертурой 1,25) и (b) эволюции биомассы агрегатов G. stearothermophilus. в (б) Нарисовано в полулогарифмическом масштабе, чтобы подчеркнуть линейность темпа роста (пунктирная линия).
На рис. 6б,в представлена биомасса клеточных популяций в поле зрения в зависимости от времени за весь период сбора данных. Быстрый распад сухой массы, наблюдаемый при \(t=5\)h на рис. 6б, в, за счет выхода части клеток из поля зрения. Скорость роста этих четырех событий равна \(0,77\pm 0,1\) ч-1. Это значение выше, чем скорость роста, указанная на рисунках 3, 3 и 4, где клетки растут нормально. Причина повышенной скорости роста G. stearothermophilus из спор неясна, но эти измерения подчеркивают интерес к LA-HTM и работают на уровне отдельных клеток (или на уровне отдельных мКОЕ), чтобы узнать больше о динамике клеточной жизни. .
Чтобы дополнительно продемонстрировать универсальность LA-HTM и его эффективность при высоких температурах, мы исследовали рост Sulfolobus shibatae, гипертермофильной ацидофильной археи с оптимальной температурой роста 80°C51. По сравнению с G. stearothermophilus эти археи также имеют совершенно другую морфологию, напоминая сферы размером 1 микрон (кокки), а не удлиненные палочки (бациллы).
Рисунок 7a состоит из последовательных изображений оптической глубины mCFU S. shibatae, полученных с использованием CGM (см. Художественный фильм M7 в дополнительных материалах). Эта мКОЕ растет при температуре около 73°C, что ниже оптимальной температуры 80°C, но в пределах температурного диапазона активного роста. Мы наблюдали множественные события деления, из-за которых через несколько часов mCFU стали выглядеть как микровиноградины архей. По этим ОТ-изображениям биомасса мКОЕ была измерена с течением времени и представлена на рисунке 7b. Интересно, что мКОЕ S. shibatae демонстрировали линейный рост, а не экспоненциальный рост, наблюдаемый в случае мКОЕ G. stearothermophilus. Давно ведется дискуссия 52 о природе скорости роста клеток: в то время как в некоторых исследованиях сообщается о скорости роста микробов, пропорциональной их размеру (экспоненциальный рост), другие показывают постоянную скорость (линейный или билинейный рост). Как объяснил Цур и др.53, различие между экспоненциальным и (би)линейным ростом требует точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Как объяснил Цур и др.53, различие между экспоненциальным и (би)линейным ростом требует точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Как объяснили Цур и др.53, различение экспоненциального и (би)линейного роста требует точности <6% в измерениях биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Как объяснил Зур и др.53, различие между экспоненциальным и (би)линейным ростом требует точности <6% при измерении биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии.Как объяснили Zur et al. 53, различие между экспоненциальным и (би)линейным ростом требует точности менее 6% при измерении биомассы, что недостижимо для большинства методов QPM, даже когда используется интерферометрия. CGM достигает этой точности с точностью до грамма при измерении биомассы36,48.
a Промежуток времени, состоящий из 6 ОТ-изображений (масляная иммерсия, 60x, объектив NA 1,25) и (b) эволюции биомассы микро-КОЕ, измеренной с помощью CGM. Дополнительную информацию смотрите в фильме M7.
Совершенно линейный рост S. shibatae был неожиданным и о нем еще не сообщалось. Однако ожидается экспоненциальный рост, хотя бы потому, что со временем должны произойти множественные деления 2, 4, 8, 16… клеток. Мы предположили, что линейный рост может быть обусловлен торможением клеток из-за плотной упаковки клеток, точно так же, как рост клеток замедляется и в конечном итоге достигает состояния покоя, когда плотность клеток слишком высока.
В заключение мы обсудим по очереди следующие пять интересных моментов: уменьшение объема нагрева, уменьшение тепловой инерции, интерес к наночастицам золота, интерес к количественной фазовой микроскопии и возможный температурный диапазон, в котором можно использовать LA-HTM.
По сравнению с резистивным нагревом, лазерный нагрев, используемый для разработки HTM, имеет ряд преимуществ, которые мы проиллюстрируем в этом исследовании. В частности, в жидких средах в поле зрения микроскопа объем нагрева удерживается в пределах нескольких (10 мкм) 3 объемов. Таким образом, только наблюдаемые микробы активны, а остальные бактерии находятся в состоянии покоя и могут быть использованы для дальнейшего изучения образца – нет необходимости менять образец каждый раз, когда необходимо проверить новую температуру. Кроме того, микромасштабный нагрев позволяет напрямую исследовать большой диапазон температур: рисунок 4в получен из 3-часового фильма (фильм М3), который обычно требует подготовки и исследования нескольких образцов — по одному на каждый из исследуемых образцов. y — температура, обозначающая количество дней эксперимента. Уменьшение нагретого объема также сохраняет все окружающие оптические компоненты микроскопа, особенно объектив, при комнатной температуре, что до сих пор было серьезной проблемой, с которой сталкивается сообщество. LA-HTM можно использовать с любыми линзами, в том числе с масляно-иммерсионными линзами, и он будет оставаться при комнатной температуре даже при экстремальных температурах в поле зрения. Основное ограничение метода лазерного нагрева, о котором мы сообщаем в этом исследовании, заключается в том, что клетки, которые не прилипают или не плавают, могут находиться далеко от поля зрения и их трудно изучать. Обходным решением может быть использование линз с малым увеличением для достижения большего повышения температуры, превышающего несколько сотен микрон. Такая осторожность сопровождается снижением пространственного разрешения, но если целью является изучение движения микроорганизмов, высокое пространственное разрешение не требуется.
Временной масштаб нагрева (и охлаждения) системы \({{{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) зависит от ее размера , по закону \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), где \ (L\) — характерный размер источника тепла (диаметр лазерного луча в нашем исследовании \(L\ около 100\) мкм), \(D\) — температуропроводность среды (средняя по нашим случай, стекло и вода Скорость диффузии\(D\ около 2\кратного {10}^{-7}\) м2/с. Поэтому в данном исследовании временные отклики порядка 50 мс, т.е. квазимгновенные. можно ожидать изменения температуры. Такое мгновенное установление повышения температуры не только сокращает продолжительность эксперимента, но также позволяет точно рассчитать время \(t=0\) для любого динамического исследования температурных эффектов.
Предлагаемый нами метод применим к любой светопоглощающей подложке (например, к коммерческим образцам с покрытием ITO). Однако наночастицы золота способны обеспечить высокое поглощение в инфракрасном диапазоне и низкое поглощение в видимом диапазоне, последние характеристики которых представляют интерес для эффективного оптического наблюдения в видимом диапазоне, особенно при использовании флуоресценции. Кроме того, золото биосовместимо, химически инертно, оптическую плотность можно регулировать от 530 нм до ближнего инфракрасного диапазона, а пробоподготовка проста и экономична29.
Микроскопия волнового фронта с поперечной решеткой (CGM) позволяет не только картировать температуру на микромасштабе, но и контролировать биомассу, что делает ее особенно полезной (если не необходимой) в сочетании с LA-HTM. За последнее десятилетие были разработаны другие методы температурной микроскопии, особенно в области биовизуализации, и большинство из них требуют использования термочувствительных флуоресцентных зондов54,55. Однако эти методы подверглись критике, и в некоторых отчетах были измерены нереальные изменения температуры внутри клеток, возможно, из-за того, что флуоресценция зависит от многих факторов, помимо температуры. Кроме того, большинство флуоресцентных зондов нестабильны при высоких температурах. Таким образом, QPM и, в частности, CGM представляют собой идеальный метод температурной микроскопии для изучения жизни при высоких температурах с использованием оптической микроскопии.
Исследования S. shibatae, которые оптимально живут при 80°C, показывают, что LA-HTM можно применять для изучения гипертермофилов, а не только простых термофилов. В принципе, нет предела диапазону температур, которые могут быть достигнуты с помощью LA-HTM, и даже температуры выше 100°C могут быть достигнуты при атмосферном давлении без кипения, как продемонстрировала наша группа из 38 человек, занимающихся гидротермальной химией при атмосферном давлении. давление А. Таким же образом для нагрева наночастиц золота 40 используется лазер. Таким образом, LA-HTM может быть использован для наблюдения за беспрецедентными гипертермофилами с помощью стандартной оптической микроскопии высокого разрешения в стандартных условиях (т.е. в условиях стресса окружающей среды).
Все эксперименты проводились с использованием самодельного микроскопа, включая подсветку Келера (со светодиодом, M625L3, Thorlabs, 700 мВт), держатель образца с ручным перемещением по оси Xy, объективы (Olympus, 60x, NA 0,7, воздушные, LUCPlanFLN60X или 60x, NA 1,25, масло). , UPLFLN60XOI), CGM-камера (перекрестная решетка QLSI, шаг 39 мкм, 0,87 мм от датчика камеры Andor Zyla) для получения изображений интенсивности и волнового фронта, а также камера sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3, 16-битный режим, от Hamamatsu) для записи данные показаны на фигуре 5 (бактериальное плавание). Дихроичный светоделитель представляет собой кромку BrightLine с длиной волны 749 нм (Semrock, FF749-SDi01). Фильтр на передней панели камеры представляет собой короткопроходной фильтр 694 (FF02-694/SP-25, Semrock). Титан-сапфировый лазер (Laser Verdi G10, 532 нм, 10 Вт, резонатор лазера цунами с накачкой, Spectra-Physics на рис. 2-5, далее заменен лазером Millenia, Spectraphysics 10 Вт, резонатор лазера Mira с накачкой, Coherent, для рис. 2) -5). 6 и 7) установлены на длину волны \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) нм, что соответствует спектру плазмонного резонанса наночастиц золота. Пространственные модуляторы света (1920 × 1152 пикселя) были приобретены у Meadowlark Optics. Голограммы рассчитывались с использованием алгоритма Герхберга-Сакстона, как описано в ссылке 39.
Микроскопия волнового фронта с перекрестной решеткой (CGM) — это метод оптической микроскопии, основанный на объединении двумерной дифракционной решетки (также известной как перекрестная решетка) на расстоянии одного миллиметра от сенсора обычной камеры. Самый распространенный пример CGM, который мы использовали в этом исследовании, называется четырехволновым интерферометром поперечного сдвига (QLSI), где перекрестная решетка состоит из шахматной доски интенсивности / фазы, представленной и запатентованной Primot et al. в 2000 году34. Вертикальные и горизонтальные линии решетки создают на датчике решетчатые тени, искажения которых можно численно обработать в реальном времени для получения искажения оптического волнового фронта (или эквивалентного фазового профиля) падающего света. При использовании в микроскопе камера CGM может отображать оптическую разность хода отображаемого объекта, также известную как оптическая глубина (ОТ), с чувствительностью порядка нанометров36. При любом измерении CGM, чтобы устранить любые дефекты в оптических компонентах или лучах, необходимо получить первичное эталонное ОТ-изображение и вычесть его из любых последующих изображений.
Температурную микроскопию проводили с использованием камеры CGM, как описано в ссылке. 32. Короче говоря, нагрев жидкости меняет ее показатель преломления, создавая эффект тепловой линзы, который искажает падающий луч. Это искажение волнового фронта измеряется CGM и обрабатывается с использованием алгоритма деконволюции для получения трехмерного распределения температуры в жидкой среде. Если наночастицы золота равномерно распределены по образцу, можно составить температурное картирование в областях, свободных от бактерий, чтобы получить более качественные изображения, что мы иногда и делаем. Эталонное изображение CGM было получено без нагрева (с выключенным лазером), а затем зафиксировано в том же месте изображения с включенным лазером.
Измерение сухой массы осуществляется с использованием той же камеры CGM, которая используется для получения изображений температуры. Эталонные изображения CGM были получены путем быстрого перемещения образца по осям x и y во время экспозиции, чтобы усреднить любую неоднородность OT из-за присутствия бактерий. Из ОТ-изображений бактерий их биомассу получали с использованием ансамбля изображений по областям, выбранным с помощью самодельного алгоритма сегментации Matlab (см. подраздел «Числовой код»), следуя процедуре, описанной в ссылке. 48. Короче говоря, мы используем соотношение \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), где \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) — изображение оптической глубины, \(m\) — сухой вес и \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) является константой. Мы выбрали \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) мкм3/пг, что является типичной константой для живых клеток.
Покровное стекло диаметром 25 мм и толщиной 150 мкм, покрытое наночастицами золота, помещали в камеру AttofluorTM (Thermofisher) наночастицами золота вверх. Geobacillus stearothermophilus предварительно культивировали в течение ночи в среде LB (200 об/мин, 60°C) перед каждым днем экспериментов. Каплю 5 мкл суспензии G. stearothermophilus с оптической плотностью (ОП) от 0,3 до 0,5 помещали на покровное стекло с наночастицами золота. Затем на каплю опускали круглое покровное стекло диаметром 18 мм с отверстием диаметром 5 мм в центре и на центр лунки повторно наносили по 5 мкл бактериальной суспензии с той же оптической плотностью. Лунки на покровных стеклах готовили в соответствии с методикой, описанной в работе. 45 (дополнительную информацию см. в разделе «Дополнительная информация»). Затем добавьте 1 мл среды LB к покровному стеклу, чтобы предотвратить высыхание жидкого слоя. Последнее покровное стекло помещают на закрытую крышку камеры Attofluor™, чтобы предотвратить испарение среды во время инкубации. Для экспериментов по проращиванию использовали споры, которые после обычных опытов иногда покрывали верхнее покровное стекло. Аналогичный метод был использован для получения Sulfolobus shibatae. Трехдневное (200 об/мин, 75°С) предварительное культивирование Thiobacillus serrata проводили в среде 182 (ДСМЗ).
Образцы наночастиц золота были приготовлены методом мицеллярной блок-сополимерной литографии. Подробно этот процесс описан в гл. 60. Вкратце, мицеллы, инкапсулирующие ионы золота, были синтезированы путем смешивания сополимера с HAuCl4 в толуоле. Очищенные покровные стекла затем погружали в раствор и обрабатывали УФ-облучением в присутствии восстановителя для получения золотых семян. Наконец, золотые семена выращивали путем контакта покровного стекла с водным раствором KAuCl4 и этаноламина в течение 16 минут, что приводило к квазипериодическому и очень равномерному расположению несферических наночастиц золота в ближней инфракрасной области.
Чтобы преобразовать интерферограммы в ОТ-изображения, мы использовали самодельный алгоритм, подробно описанный в ссылке. 33 и доступен в виде пакета Matlab в следующем общедоступном репозитории: https://github.com/baffou/CGMprocess. Пакет может рассчитывать интенсивность и изображения ОТ на основе записанных интерферограмм (включая эталонные изображения) и расстояний от массива камер.
Чтобы рассчитать фазовую диаграмму, применяемую к SLM для получения заданного температурного профиля, мы использовали ранее разработанный самодельный алгоритм39,42, который доступен в следующем общедоступном репозитории: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Входными данными является желаемое поле температуры, которое можно задать в цифровом виде или с помощью монохромного изображения в формате BMP.
Чтобы сегментировать клетки и измерить их сухой вес, мы использовали наш алгоритм Matlab, опубликованный в следующем общедоступном репозитории: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. На каждом изображении пользователь должен щелкнуть интересующую бактерию или мКОЕ, настроить чувствительность зонда и подтвердить выбор.
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. аннотацию отчета о природных исследованиях, связанную с этой статьей.
Данные, подтверждающие результаты этого исследования, можно получить у соответствующих авторов по обоснованному запросу.
Исходный код, использованный в этом исследовании, подробно описан в разделе «Методы», а отладочные версии можно загрузить с https://github.com/baffou/ в следующих репозиториях: SLM_temperatureShaping, CGMprocess и CGM_magicWandSegmentation.
Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К. Взгляд на термофилы и их широкий спектр применения. Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К. Взгляд на термофилы и их широкий спектр применения.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К. Обзор термофилов и их широкое применение. Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К. Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К.Мехта Р., Сингхал П., Сингх Х., Дамле Д. и Шарма А.К. Глубокое понимание термофилов и широкий спектр применений.3 Биотехнология 6, 81 (2016).
Время публикации: 26 сентября 2022 г.